Clonatge d'ADN i PCR: Conceptes Clau i Aplicacions
Clonatge d'ADN: Conceptes i Tècniques
El clonatge d'un gen consisteix a inserir-lo en un vector de clonatge per tal de poder-lo introduir en una cèl·lula hoste, en la qual pot ser copiat i mantingut.
Què són els Vectors de Clonatge?
Els vectors de clonatge són molècules d'ADN que tenen la capacitat d'entrar en una cèl·lula i de replicar-s'hi. Hi ha diverses classes de vectors:
- Plasmidis
- Bacteriòfags
- Cromosomes bacterians
- Cromosomes de llevats
L'elecció d'un vector o un altre depèn de la mida del fragment d'ADN que es vulgui clonar. Per al clonatge de fragments d'ADN petits, els vectors més utilitzats són els plasmidis, molècules d'ADN circulars que es poden autoreplicar en bacteris. Aquests, en reproduir-se, amplifiquen el nombre de plasmidis amb el gen d'interès.
Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR)
El clonatge d'ADN tradicional és una tècnica molt laboriosa. El 1983, Kary Mullis va desenvolupar una nova tècnica revolucionària anomenada Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR). Aquesta tècnica permet clonar un fragment d'ADN milers de milions de vegades en poques hores, tot en un tub d'assaig.
Components Essencials per a la PCR
Per dur a terme la PCR, es necessiten els components següents:
- El fragment d'ADN que es vol amplificar.
- Els encebadors, amb seqüències complementàries de cadascun dels extrems 3’ del fragment d'ADN que es vol clonar.
- Un enzim ADN polimerasa resistent a la calor, que s'aïlla de bacteris que viuen en ambients sotmesos a altes temperatures (entre 60 i 80 ºC).
- Els quatre tipus de desoxiribonucleòtids trifosfat i altres cofactors de l'ADN polimerasa en un amortidor adequat.
Etapes del Cicle de la PCR
Aquests reactius es mesclen en un tub d'assaig que s'introdueix en un aparell anomenat termociclador, el qual realitza cicles de tres etapes:
- Desnaturalització: S'eleva la temperatura a 90°C–100°C per separar les cadenes del fragment d'ADN que es vol amplificar.
- Hibridació: A una temperatura d'uns 50 °C, els encebadors s'uneixen a les seqüències complementàries en cadascuna de les cadenes d'ADN.
- Elongació: A uns 70°C, l'ADN polimerasa és activa i sintetitza les cadenes noves d'ADN.
Aquest cicle complet es repeteix múltiples vegades per aconseguir l'amplificació desitjada.