Microscòpia Òptica i Electrònica: Preparació de mostres i Estructura cel·lular

MICROSCOPIA:

-MICROSCOPI ÒPTIC

Sistema òptic format per dues lents, objectiu i ocular, que fa servir fotons per observar les cèl·lules.

La llum, procedent d’una font d’il·luminació (sol o làmpada), degudament concentrada sobre la preparació amb el condensador, travessa el portaobjectes, la mostra, el medi que l’engloba, el cubreobjectes, i arriba a l’objectiu que augmenta la imatge, després hi ha l’ocular que la torna a augmentar, fins arribar directament a l’ull de l’humà que l’observa.

Les mostres observades han de ser molt fines, de només unes μ de gruix perquè la llum les travessi. Sovint cal tenyir les mostres ja que en talls tan prims no hi ha color.

Es poden veure cèl·lules vives, on l’observació de detalls és difícil.

Els microscopis òptics permeten un augment de fins a 1.000 augments i una resolució de 0,2 μ, depenent molt de la qualitat de les lents.

ENFOC PER UNA PREPARACIÓ:

Primer cal il·luminar correctament la preparació, sempre és preferible poca llum al principi, per tant cal tancar el diafragma i/o allunyar el condensador.

A continuació girar el revòlver dels objectius per posar el de menor augment, amb el que enfocaràs.

Seguidament, sense mirar per l’ocular, cal ajuntar al màxim l’objectiu a la platina, mirant que no es toquin.

A partir d’aquí, ara mirant per l’objectiu, únicament separa la platina de l’objectiu amb el cargol macromètric. Un cop vegis més o menys les cèl·lules, acaba d’enfocar amb el cargol micromètric.

Si cal ajusta l’intensitat de la llum.

Un cop ho vegis perfectament, si vol pots canviar a un major augment girant el revòlver dels objectius, en principi ha de quedar ben enfocat, en tot cas acaba d’ajustar-ho amb el cargol micromètric i corregeix la il·luminació.

PREPARACIÓ de MOSTRES pel MICROSCOPI ÒPTIC

1. Fixació: Tractar la mostra amb conservants que preserven la morfologia i la composició química de la cèl. Habitualment s’utilitza etanol al 70%, formaldehid, glutaraldeheid, líquid de Bouin, líquid de Carnoy...
2. Inclusió: Si els teixits són rígids els talls es poden fer directament, però si són tous cal incloure’ls en un entorn prou rígid que permeti fer talls prou prims sense deformar-los. Habitualment s’utilitza parafina fosa a 60º que penetra dins els teixits, i que quan es refreda solidifica. Com la parafina és hidròfoba, abans de la inclusió cal deshidratar la mostra amb alcohol.
3. Tall en capes primíssimes, sovint ajudat d’un micròtom que permet talls de 6 a 12 μ.
4. 4.   Tinció: Els tall es posen damunt el portaobjectes per tenyir-los. S’utilitza diferents colorants segons la composició química d’aquella estructura que es vol veure. N’hi ha un munt: hematoxilina, eosina, blau de metilè, orceïna, safranina, picrofucsina, Sudan, verd metil... Es poden fer tincions dobles o triples.
5. 5.   Muntatge: La mostra es posa en el portaobjectes, amb un medi de muntatge transparent i viscós, i al damunt el posa el cobreobjectes, formant una estructura compacta que farà la preparació resistent; després es segellen les vores. El medis de muntatge habituals són el bàlsam del Canadà, goma aràbiga, glicerina, DPX, Eurapal, gelatina glicerinada...

MICROSCOPI ELECTRÒNIC

Per veure les preparacions es fa travessar la mostra amb un feix d’electrons, que en ser molt més petits que els fotons de la llum, permeten un molt major augment i resolució.

Hi ha dos tipus de microscopis electrònics:

- M.E. de transmissió (MET): Els electrons travessen la mostra i van a parar a una pantalla fluorescent. Permeten 1.000.000 augments i una resolució de 4 Å.

• M.E. de rastreig (MER): Els electrons són reflectits per la superfície de la mostra, oferint imatges en tres dimensions. Permeten 200.000 augments. En castellà es diu M.E. de barrido.

Les imatges obtingudes s’anomenen micrografies i el que es veu de les cèl·lules s’anomena ultraestructura.

PREPARACIÓ de MOSTRES pel MICROSCOPI ELECTRÒNIC:

El sistema és molt diferent a l’utilitzat amb el microscopi òptic.

1. Prefixació amb glutaraldehid i fixació amb tetròxid d’osmi.
2. Inclusió en resina plàstica.
3. Fer talls molt més fins (de 150 a 500 Å) amb l’ultramicròtom.
4. No hi ha tinció. Les imatges són el blanc i negre.
5. Els talls es col·loquen sobre una reixeta i s’hi fixen amb col·lodió.
6. Si cal es fa un contrast amb solucions de metalls pesants per ressaltar estructures.

El Nombre d’Augments és la proporció entre la mida aparent de la imatge i la mida real de l’objecte.

En el microscopi òptic és el producte entre el que indica d’augment l’objectiu i el del ocular. Un major augment no significa una millor visió; en un microscopi és més important el poder de resolució.

ESTRUCTURA dels MICRO-ORGANISMES

Microbi o microorganisme, són éssers vius petits, uni o pluricel·lulars, auto o heteròtrofs, que necessiten del microscopi per ser observats.

La major part són procariotes, també hi ha eucariotes. Totes les seves cèl. poden fer per si soles les tres funcions vitals.

Es troben en els tres dominis, els dos primers procariotes, el tercer eucariota:

                - Archaea són els arqueobacteris

                - Bacteria: són els eubacteris

                - Eukarya: són els protoctists (algues microscò-piques i protozous) i els fongs microscòpics.

Els virus NO es consideren éssers vius, sinó matèria viva. No tenen vida autònoma.

EUBACTERIS:

Microbis procariotes, auto o heteròtrofes, aerobis o anaerobis. De mida variable, de menys de 1μ a les 700 μ.

Hi ha quatre tipus morfològics:

                - Bacils: forma de bastó

                - Cocs: forma d’esfera

                - Espirils: forma de bastó cargolat

                - Vibrions: forma de coma.

ESTRUCTURA BACTERIANA

La interna és més simple que l’eucariota, en canvi l’externa és mes complexa, ja que són unicel·lulars i els cal protegir-se de l’entorn.

Tenen:

• • Càpsula
  • Paret
  • Membrana plasmàtica
  • Ribosomes
  • Inclusions citoplasmàtiques
  • Estruct. membranoses intracitoplasmàtiques
  • Estructures delimitades per parets proteiques
  • Cromosoma circular bacterià: nucleoide.

ARQUEOBACTERIS

Microbis procariotes, anaerobis, autòtrofes i extremòfils.

Tenen una membrana amb lípids que no són àcids grassos sinó hidrocarburs isoprenoides units a glicerol mitjançant l’enllaç èter (-C-O-C-) en lloc de l’èster (-CO-O-C-). Aquest isoprenoides són amfipàtics, i formen membranes monocapes o bicapes.

Tenen parets cel·lulars amb pseudopeptidogli-cans i polisacàrids o proteïnes segons espècies

Genoma format per una sola molècula de DNA circular associat a histones.

Es diferencien tres grups d’arqueobacteris:

                - Halòfils: viuen en ambients hiperhalins.

                - Termòfils: viuen en aigües termals i hàbitats volcànics rics en sofre.

                - Metanògens: viuen en condicions d’anaerobiosi, produeixen metà (CH₄) a partir de diferents substrats.

MICRO-ORGANISMES EUCARIOTES:

Eucariotes uni o pluricel·lulars microscòpics:

                - Protoctists: algues (autòtrofes) i protozous (heteròtrofes).

                - Fongs: heteròtrofes.

ALGUES MICROSCÒPIQUES

Fan la fotosíntesi gràcies als cloroplasts que tenen pigments fotosintètics com clorofil·les, carotens i xantofil·les.

Viuen en medis aquàtics, al mar o aigües dolces, formant el fitoplàncton (productors de la cadena alimentària), a aigües termals, al fang i sobre escorça d’arbres.

DIVERSOS GRUPS: Euglenòfits, Diatomees, Pirròfits

PROTOZOUS

Unicel·lulars, eucariotes i heteròtrofes, sense membrana de secreció, tenen capacitat de locomoció i sensibilitat davant d’estímuls.

Tenen entre 3 i 800 μ, poden formar colònies, viuen en ambient aquàtics o terrestres molt humits. La major part són de vida lliure.

Poden moure’s per pseudopodis, cilis o flagels.

S’alimenten de bacteris, algues unicel·lulars o altres protozous.

Reproducció asexual per divisió binària (gairebé igual a la mitosi) o per esporulació

Es divideixen en grups segons la forma de locomoció:

                - Per flagels: Mastigòfors (flagel·lats)

                - Per pseudopodis: Sarcodinis (amebes)

                - Per cilis: Ciliòfors (ciliats)

                - Per contracció del cos: Apicomplexos

FONGS MICROSCÒPICS

Eucariotes heteròtrofes, uni o pluricel·lulars.

S’alimenten de l’absorció de matèria orgànica prèviament digerida gràcies a l’excreció d’enzims digestius.

Els unicel·lulars s’anomenen llevats, que viuen en ambient ensucrats i es reprodueixen asexualment per gemmació. Són d’utilització industrial (vi, cervesa, pa).

Els pluricel·lulars s’anomenen floridures i constitueixen uns filaments anomenats hifes.

VIRUS:

Genoma víric: Una o diverses molècules de DNA o RNA, mono o bicatenari, de cadena oberta o circular.

Càpsida: Coberta proteica que envolta el genoma amb la funció

de protegir el genoma i de reconèixer els receptors de membrana dels hostes.

MEMBRANA PLASMÀTICA:

També membrana unitària o cel·lular, ja que és la mateixa que envolta i delimita moltes de les estructures i orgànuls cel·lulars.

Capa que envolta, delimita, protegeix, separa la cèl·lula del medi, a la vegada que li permet també la comunicació amb ell, ja que, en posseir una permeabilitat selectiva, regula l’entrada i sortida de substàncies.

Funcions de la matriu extracel·lular:

• Nexe d’unió entre les cèl·lules en la formació de teixits i òrgans; omplir espais buits.
• Donen consistència, elasticitat i resistència a la tracció als teixits i als òrgans.
• Gràcies a l’aigua continguda, dona resistència a la compressió.
• Formen gels, el que facilita la migració cel·lular i la difusió molecular.

ESTRUCTURES NO MEMBRANOSES:

CITOPLASMA:

Citoplasma és l’espai comprés entre la membrana plasmàtica i el nucli. En ell hi ha:

• • Citosol: part líquida
  • Estructures cel·lulars:
    • Sistemes NO membranosos: citosquelet, centrosoma, cilis i flagels, ribosomes, inclusions citoplasmàtiques
    • Sistemes membranosos: aparell de Golgi, reticle endoplasmàtic llis i rugós, vacúols, vesícules, lisosomes, peroxisomes, glioxisomes

Orgànuls cel·lulars: mitocondris i cloroplasts

CITOESQUELET:

Present a totes les cèl·lules eucariotes (animals i veget).

Estructura: És una xarxa tridimensional de filaments de proteïnes amb funció esquelètica.

    Hi ha tres tipus de filaments: microfilaments, filaments intermedis i microtúbuls. A més hi ha una munió d’altres proteïnes associades als filaments.

Funcions:

                - Mantenir o canviar la forma de cèl·lula

                - Possibilitar el desplaçament de la cèl·lula

                - Fer la contracció

                - Transportar i organitzar les estructures i orgànuls

CENTROSOMA:

També anomenat citocentre o centre cel·lular, es troba al citoplasma, proper al nucli. Conté el COM (centre organitzador de microtúbuls). Al microscopi òptic és difícil de veure, és una matèria clara i refringent.

És el centre dinàmic de la cèl·lula, ja que a partir d’ell es generen els microtúbuls responsables del moviment intern i extern de la cèl·lula.

Hi ha dos tipus de centrosomes:

                - Amb centríols a l’interior: a algues, protozous i cèl·lules animals.

                - Sense centríols a l’interior: a fongs i angiospermes. No està ben definit, és una zona del citoplasma.

A l’interior del centrosoma hi ha el diplosoma, format per dos centríols disposats de manera perpendicular, immers en un material dens (material pericentriolar).

CILIS i FLAGELS

Els undulipodis són prolongacions el citoplasma mòbils, situades a la superfície cel·lular.

Les funcions és el desplaçament de la cèl·lula o el crear corrents d’aigua que atraguin l’aliment o el desplaçar substàncies externes

Cilis: Diàmetre de 0,2μ i longitud de 5 a 10μ. Hi ha molts, recobrint la superfície cel·lular.

Flagels: Diàmetre de 0,2μ i longitud de 100μ. Hi ha pocs, un o dos.

RIBOSOMES

Són estructures globulars, amembranoses i poroses, es formen al nuclèol, estan constituïts per proteïnes associades a RNA_r i aigua . Es poden trobar sols o adherits al reticle endoplasmàtic rugós amb riboforines.

La seva funció és la síntesi de proteïnes: El RNA_m s’uneix a la subunitat petita de ribosoma per l’extrem 5’; posteriorment s’uneix la gran i s’inicia la traducció del missatge. Es comencen a codificar aminoàcids a partir del triplet d’iniciació AUG, moment a partir del qual el RNA_t porta al ribosoma els aminoàcids corresponents segons el que indiqui el triplet del RNA_m.

ESTRUCTURES DELIMITADES per MEMBRANES

• • Reticle endoplasmàtic:
    • Rugós
    • Llis
  • Aparell de Golgi
  • Lisosomes
  • Vacúols
  • Peroxisomes

Glioxisomes.

RETICLE ENDOPLASMÀTIC

Xarxa de sàculs aplanats, cisternes, canals, tubs sinuosos i vesícules que s’estenen per tot el citoplasma. Formats per una doble membrana plasmàtica;

Les funcions són: síntesi, magatzem i transport intern de proteïnes i lípids; la unió d’aquests amb glúcids, així com la transformació de substàncies tòxiques en no tòxiques.

R.E RUGÓS:

Estructura: Xarxa de cisternes, sàculs i vesícules formades per la mateixa doble capa de fosfolípids i proteïnes de la membrana, que a la cara externa presenten ribosomes.

   Funcions: Sintetitzar les proteïnes i els fosfolípids que formen la mateixa membrana, constituir-la, i a través de vesícules portar-la a altres estructures o a la membrana plasmàtica.

Fabricar proteïnes de secreció, que si cal glicosilar-les (glicoproteïnes), ho faran anant a l’aparell de Golgi a través de vesícules.

R.E LLIS:

Estructura: Xarxa tubs i canals formades per la doble capa de fosfolípids i proteïnes de la membrana, que a la cara externa NO presenten ribosomes.

Funcions:

- Destoxicació de la cèl·lula transformant substàncies perjudicials en altres de menys tòxiques.

- Síntesi, magatzem i transport de lípids (fosfolípids, glicolípids, colesterol, hormones, esteroides...). Els àcids grassos es sintetitzen al citosol. Posteriorment són transportats a altres orgànuls mitjançant vesícules.

- Participen en la contracció muscular estriada ja que controlen els ions Ca²⁺ presents al citoplasma.

APARELL de GOLGI

També anomenat complex de Golgi. És un sistema de membranes que es situa proper al nucli, i en les cèl. animals envolten els centríols.

Estructura: Format per un o més dictiosomes: agrupacions en paral·lel de 4 a 8 sàculs discoïdals, cisternes, amb nombroses vesícules pels voltants.

Està molt polaritzat, presenta dues capes amb diferent estructura i funció:

        - Cara cis o de formació: orientada al RER, convexa, formada per cisternes petites i de membrana prima.

        - Cara trans o de maduració; orientada cap a la membrana, còncava, formada per cisternes més grans i de membrana més gruixuda.

A la cara cis, hi han les vesicules de trsnsició.

A la cara trans hi han vesícules intercisternes. També hi han:

- Els lisosomes són vesícules que contenen  enzims i tenen funció digestiva.

- Les vesícules de secreció són grans i es dirigeixen cap a la membrana per treure per exocitosi el seu contingut a l’exterior.

Funcions de l’Aparell de Golgi:

• Maduració, acumulació, transport, concentració i secreció de substàncies procedents del RE.
• Glicosilació de lípids i proteïnes.
• Síntesi de polisacàrids que constituiran, amb la secreció, les parets cel·lulars (cel·lulosa) o la matriu extracel·lular (proteoglicans).

LISOSOMES

Estructura: Son vesícules procedents de l’aparell de Golgi que contenen enzims digestius (hidrolases que trenquen principis immediats en afegir-les aigua).

El lisosoma primari només conté enzims, el secundari és el que s’ha unit a un vacúol digestiu que conté matèria orgànica, i la digereix. Del secundari hi ha els digestiu i els autofàgic.

VACUOLS

Estructura: Esfera constituïda per membrana amb un interior aquós, que s’originen a partir de RE o l’AG o per invaginacions de la membrana.

Funcions dels vacúols a les cèl·lules vegetals:

                - Acumular aigua dins la cèl per augmentar la seva turgència sense variar la quantitat de citoplasma ni la seva salinitat.

                - Emmagatzemar substàncies diferents elaborades per la mateixa cèl·lula: de reserva energètica, productes de rebuig, substàncies específiques.

                - Transport de substàncies entre el sistema endomembranós (RE, AG) i el medi extern.

Funcions dels vacúols a les cèl·lules animals:

                - Vacúols nutritius: heterofàgics o autofàgics

                - Vacúols pulsàtils per regular pressió osmòtica

PEROXISOMES

Vesícules de 0,1 a 0,5 µ de diàmetre (grans) procedents del RE, que contenen enzims oxidatius (oxidases i catalases) que tenen la funció de d’oxidar substàncies perjudicials per a la cèl. (àc. úric, àc. làctic, etanol, formol, aminoàcids...).

GLIOXISOMES

Són una mena de peroxisomes presents només a les cèl·lules vegetals, que contenen els enzims responsables del cicle de l’àcid glioxílic, variant del cicle de Krebs, que permet sintetitzar glúcids a partir de lípids, essencial per a la germinació de llavors.

ESTRUCTURA CEL·LULAR: ORGÀNULS CEL·LULARS

Els orgànuls presents a la cèl·lula eucariota són:

• • Mitocondris
  • Cloroplasts.

MITOCONDRIS

Orgànuls que s'encarreguen d’obtenir energia per a la cèl·lula mitjançant la respiració cel·lular, procés d’oxidació controlat per ATPsintases pel qual, a partir de la glucosa, s’obté ATP.

Estructura:

- Recoberts per una doble membrana. L’externa és llisa; té moltes proteïnes transportadores. La interna és força impermeable. Els lípids que formen aquestes membranes NO contenen colesterol, igual que les membranes dels bacteris

- La membrana interna forma uns replecs perpen-diculars a la longitud principal anomenats crestes

- Les crestes limiten una matriu mitocondrial amb una composició semblant al del citosol

- Tenen uns grànuls densos formats per diferents substàncies, de reserva i o amb funció enzimàtica- Tenen ribosomes 70s

- Tenen un nucleoide (DNA bicatenari circular).

Funció: Finalitzar la degradació aeròbica de la glucosa, la qual té diferents fases:

                - Glucòlisis: Pas de una molècula de glucosa (C6) a dues d’ac. pirúvic (C3). Es produeix al citoplasma cel·lular.

                - Aquesta molècula (C3) entra al mitocondri.

                - Pas del l’ac. pirúvic (C3) a acetil-CoA (C2) i es desprén CO₂.

                - Entrada al Cicle de Krebs, que es duu a terme en la matriu mitocondrial, on s’acaben d’oxidar els dos carbonis i es desprenen en forma de CO₂.

                - Aquest procés produeix gran quantitat de protons (H⁺)

CLOROPLASTS

Orgànuls que s'encarreguen d’obtenir energia per a la cèl·lula mitjançant la fotosíntesi, procés pel qual l’energia lumínica es converteix en ATP gràcies als pigments fotosintètics.SÓN VERDS.

Estructura:

                - Recoberts per una doble membrana; cap de les dues té clorofil·la ni colesterol entre els fosfolípids. L’externa és molt permeable i la interna és pràcticament impermeable, amb moltes proteïnes permeases.

                - La membrana interior delimita un citoplasma anomenat estroma amb molts components.

                - L’estroma conté inclusions: grans de midó i lipídiques

                - A l’estroma també hi ha ribosomes 70s

                - Té un nucleoide (DNA bicatenari circular)

                - Té molts enzims per a la formació de matèria orgànica a partir de CO₂

Funció: Els cloroplasts fan la fotosíntesi, la qual té dues  etapes fonamentals:

• Fase lumínica: És la fotòlisi del l’aigua. Consisteix en el trencament de l’aigua per acció del sol, alliberant-se protons, oxigen, que va a l’atmosfera, i energia (ATP). Es realitza als granul dels tilacoides, gràcies a la clorofil·la. 

• Fase fosca: Els protons produïts a la fase lumínica, s’utilitzen per convertir el CO₂ en glucosa, mitjançant el cicle de Calvin. Aquest procés consumeix ATP i es produeix a l’estroma del cloroplasts.   

4 TIPUS: cromoplsts. Leucoplasts, amiloplasts I proteoplasts.

NUCLI

Zona del citoplasma separada per un embolcall nuclear (membrana doble) que engloba un medi intern anomenat nucleoplasma, format per fibres de DNA més o menys condensades (cromatina) i un o dos corpuscles rics en RNA (nuclèols). La membrana està en relació amb el RER.

EMBOLCALL NUCLEAR

Estructura: Membrana doble que separa els processos metabòlics dels citoplasma dels del nucli. Té porus que comunica ambdues parts.

Funcions de l’embolcall nuclear:

• Separa nucleoplasma de citosol, per evitar que els enzims d’un lloc actuïn en l’altre.
• Regula l’intercanvi de substàncies a través dels porus: nucleòtids, proteïnes ribosòmiques, histones, RNA_m i enzims (DNA-polimerasa, RNA-polimerasa).
• La làmina nuclear intervé en la constitució dels cromosomes .

NUCLÈOL

Estructura: Corpuscle esfèric no recobert per membrana, d’entre 1 i 3 μ de diàmetre, que es troba dins del nucli en interfase.

Constituïts per RNA i proteïnes, s’hi distingeixen:

• Zona fibril·lar: Interior, constituïda per RNA_n 45s associat a proteïnes.

Zona granular: Perifèrica, constituïda per RNA_r

Funció: fabricar l’RNA_n que després es convertirà en RNA_r que a la vegada formarà els ribosomes.

CROMATINA

Tipus de cromatina:

                - Heterocromatina, que no es descondensa en la interfase. Té dos subtipus:

                                - Constitutiva, que es manté condensada en totes           les cèl·lules de l’organisme

                                - Facultativa, condensada només en algunes cèls.

                - Eucromatina, que sí es descondensa.

Estructura: la cromatina està constituïda per dues menes de fibres de DNA:

                - Nucleosomes o collaret de perles, de 100Å de gruix, és la eucromatina;

                - Solenoide, de 300Å, més empaquetada.

La cromatina té dues funcions:

• Conté la informació biològica de l’organisme, sobre la seva estructura i funcionament.
• Conté la informació per a la síntesi, mitjançant la transcripció, dels diferents RNA.

CROMOSOMES

Estructures en forma de bastó, producte de la condensació de la cromatina amb histones, de l’empaquetament de la fibra de DNA, que apareixen al principi de la divisió nuclear i desapareixen quan aquesta acaba.  Es tenyeixen fortament, d’aquí el seu nom.

Estructura: Les cromàtides s’uneixen pel centròmer i es mantenen unides durant la profase i la metafase; a l’anafase se separen i aleshores cada cromosoma està format per una única cromàtide.

El centròmer divideix els braços del cromosoma, és la constricció primària; també poden haver constriccions secundàries, separant-se així la darrera part d’un braç anomenada satèl·lit.

La part distal d’un braç s’anomena telòmer.

Al centròmer hi ha dues estructures proteiques en forma de disc, els cinetocors, que són els centres organitzadors dels microtúbuls,

.HAPLOÏDIA I DIPLOÏDIA

• Organismes diploides: Hi ha dos exemplars de cada cromosoma en les cèl·lules somàtiques (un de cada pare). Són els cromosomes homòlegs, que tenen informació sobre els mateixos caràcters, encara que no necessàriament la mateixa informació. Es simbolitza com 2n. Som diploides: animals, plantes superiors (angiospermes i gimnospermes) i fongs.
• Organismes haploides: Tenen un cromosoma de cada tipus. Es simbolitza com n. Són haploides els gametòfits de molses i falgueres.

TIPUS DE CELULUES:

ANIMAL-VEGETAL: