Procés d'Obtenció de DNA Recombinant: Guia Pas a Pas
L'obtenció de DNA recombinant és un pilar fonamental de l'enginyeria genètica, permetent la manipulació de gens per a diverses aplicacions biotecnològiques. A continuació, es detallen els passos clau d'aquest procés:
1. Extracció i Aïllament del Gen amb Enzims de Restricció
S'extreu el DNA i s'aïlla el gen necessari amb enzims de restricció. Aquests enzims poden realitzar un tall recte o generar un segment de nucleòtids lliures, anomenat extrem adherent, que facilita la unió a qualsevol fragment de DNA tallat amb el mateix enzim de restricció.
2. Amplificació del Gen Mitjançant PCR
El gen obtingut s'ha d'amplificar. Cal dur a terme una Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR). Consisteix en amplificar un fragment de DNA desnaturalitzant-lo (separant-lo en dos filaments) mitjançant un petit encebador i una DNA polimerasa bacteriana que opera a alta temperatura, ja que el procés requereix que els filaments de DNA es mantinguin separats. La DNA polimerasa complementa cada fragment, els quals es tornaran a separar, i el procés es repeteix. El procés segueix una progressió geomètrica: a partir de dues còpies del gen, si es repeteix unes 35 vegades, s'aconsegueixen aproximadament 60 milions de còpies.
3. Introducció del Gen en un Vector i Cèl·lula Hoste
Introduir el gen en un vector (plasmidi o virus) dins la cèl·lula hoste. Podem definir vector com les molècules de DNA que es poden replicar posteriorment dins d'una cèl·lula hoste adequada. Si és un virus, el DNA manipulat s'introdueix per transducció. Si és un plasmidi, que és una molècula de DNA (en aquest cas, recombinat), es pot introduir fàcilment en una cèl·lula hoste. Aquest procés generalment requereix un tractament seqüencial de fred, calor i substàncies químiques (com el clorur càlcic) per augmentar la permeabilitat de la paret del bacteri (cèl·lula hoste), afavorint així l'entrada del DNA.
4. Selecció de Cèl·lules amb DNA Recombinant
Quan el vector està dins de la cèl·lula hoste, es realitza un cultiu in vitro per seleccionar les cèl·lules que han incorporat el gen estudiat. Per a aquesta selecció, s'utilitza un antibiòtic al qual el DNA recombinat introduït confereix resistència. Les cèl·lules que sobreviuen són aquelles que contenen el DNA recombinat.
5. Multiplicació i Clonació del DNA Recombinant
Multiplicar les cèl·lules que han incorporat el DNA recombinant i aconseguir moltes còpies d'aquest gen. Aquesta amplificació del DNA recombinant s'anomena clonació.
6. Obtenció del Producte Final
Obtenció del producte. Aquestes cèl·lules hoste expressen la informació genètica del gen en forma de proteïna o d'un altre producte.