Clonació de productes PCR: Estratègies i vectors

4 Clonació dels productes de la PCR

Els fragments d’ADN amplificat són estables a baixes temperatures (-20 °C) durant 4 a 8 setmanes. Si es conserven a l'interior de plasmidis, són estables durant anys. Per tant, és convenient fer una clonació dels fragments obtinguts. Bàsicament, hi ha 4 estratègies per a la clonació d’aquests productes:

4.1 Clonació per extrems roms

Existeixen diversos kits comercials que permeten la clonació de fragments d’ADN que han estat amplificats amb una polimerasa que genera extrems roms, com la Pfu.

4.2 Clonació amb enzims de restricció

En aquest cas, els encebadors utilitzats en l’amplificació tenen en els seus extrems seqüències d’alguns enzims de restricció, de manera que aquestes dianes queden incloses en els extrems del producte de la PCR.

4.3 Clonació per recombinació

Es basa en la presència de seqüències homòlogues en els extrems del fragment amplificat i en el vector en què s’introduirà. Aquestes seqüències són reconegudes per enzims (integrasa i excisionasa) que transfereixen el fragment a l’interior del plasmidi.

4.4 Clonació per extrems cohesius A-T

És el mètode més utilitzat i es basa en l’addició, per part de la Taq polimerasa, d'una adenina (A) en l’extrem 3’.

Característiques d'un vector de clonació

Per servir de vector, una molècula de DNA ha de tenir unes determinades característiques:

• Ha de poder replicar-se independentment juntament amb el segment de DNA que transporta.
• Ha de contenir alguns llocs de tall per enzims de restricció, presents només una vegada en el vector. Aquests llocs de restricció es tallen amb un enzim de restricció i s'utilitzen per inserir segments de DNA tallats amb el mateix enzim.
• Ha de tenir algun marcador de selecció (normalment gens de resistència a antibiòtics o gens d'enzims que la cèl·lula hoste no té) per poder distingir les cèl·lules hoste que transporten el vector de les que no ho contenen.
• El vector de la cèl·lula hoste ha de ser fàcil de recuperar.

Actualment s'utilitzen tres tipus principals de vectors: els plasmidis, els bacteriòfags i els cosmidis.