PCR i ELISA: Tècniques de Biologia Molecular i Immunologia

PCR (Reacció en Cadena de la Polimerasa)

La PCR permet obtenir milions de còpies d'ADN a partir d'una mostra d'ADN in vitro, sense utilitzar cèl·lules vives. Necessita que es reconeguin els extrems del fragment a duplicar, formant dos oligonucleòtids sintètics d'ADN complementaris a una porció de la doble cadena. És necessari conèixer part del fragment a amplificar. Es replica una vegada i una altra, de manera exponencial.

S'utilitzen cebadors (primers) per a l'ADN polimerasa, que han de ser ben escollits per delimitar la regió a amplificar i ser complementaris als extrems 3'. S'afegeixen desoxiribonucleòtids trifosfats (dNTPs) que componen l'ADN (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) en una barreja equimolar i una ADN polimerasa especial que suporti altes temperatures.

Components Essencials de la PCR

• DNA polimerasa: Taq polimerasa, la més utilitzada (Thermus aquaticus), actua entre 75-80°C. Altra opció és la Pfu polimerasa (Pyrococcus furiosus).
• Oligonucleòtids: Fragments curts de DNA a amplificar, dissenyats específicament (Primers). Es requereixen dos per a una cadena, als extrems 3'. Són els iniciadors amb un contingut G + C aproximadament del 50%, evitant més de 4 nucleòtids de la mateixa base. No poden formar estructures secundàries i han de tenir una temperatura d'hibridació similar.
• Magnesi: El catió fa funcionar la polimerasa.
• dNTPs: Bases, a la mateixa concentració (20-200 nM).
• Buffer: Regulador de pH.

Cicle de la PCR

• Desnaturalització: 94°C.
• Alineament/Aparellament: 40-60°C. La temperatura disminueix per aconseguir la hibridació dels oligonucleòtids amb les cadenes separades del DNA motlle (½ - 2 min).
• Extensió: 72°C. Es deixa actuar la Taq Polimerasa, que utilitza la unió per sintetitzar la cadena complementària d'ADN motlle utilitzant els desoxiribonucleòtids trifosfat. Això es repeteix successivament en termocicladors.

Control Negatiu

Els components de la PCR s'emmagatzemen a -20°C a altes concentracions. Si un component no s'esgota, es pot utilitzar per a una altra reacció, així que en prendre alíquotes es pot produir una contaminació d'ADN d'alguna mostra o un error de maneig. El control negatiu (C-) comprova que cap dels components de la reacció estigui contaminat amb ADN d'una altra procedència o creuat, ja que amb molt poc ADN ja es genera quantitat.

PCR a partir d'ARN: RT-PCR (Transcripció Reversa - PCR)

El genoma d'alguns virus és ARN en lloc d'ADN, molt sensible a la calor. Cal fer una transcripció reversa (RT) abans d'iniciar l'amplificació per PCR, generant una còpia de la cadena d'ARN però en ADN complementari (cADN), estable a la calor i resistent a la PCR.

PCR Quantitativa

Permet fer una anàlisi quantitativa en temps real amb sondes marcades amb fluorocroms. Són sondes d'hidròlisi, oligonucleòtids que presenten fluorocroms en els dos extrems i tenen una seqüència complementària a part del fragment d'ADN. Cada extrem actua de manera diferent: el 5' com a donador i el 3' com a acceptor.

Quan l'ADN polimerasa arriba al punt on es troba la sonda hibridada a la cadena, la hidrolitza, fent que el fluorocrom de l'extrem 5' sigui alliberat. L'acceptor no pot absorbir la fluorescència per la distància. Aquesta és proporcional a la quantitat d'ADN present, sent més sensible i amb menys risc de fals negatiu, obtenint dades de la fase exponencial més ràpida.

S'utilitza per identificar espècies, detectar mutacions, en medicina clínica, diagnòstic prenatal, relacions filogenètiques i en l'àmbit forense.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

L'ELISA es basa en l'ús d'antígens o anticossos marcats amb un enzim, de manera que els conjugats obtinguts tinguin activitat tant immunològica com enzimàtica. En estar l'antigen o anticòs marcat amb un enzim i insolubilitzat sobre un suport (immunoadsorbent), la reacció es queda immobilitzada i, per tant, es pot revelar amb l'addició d'un substrat específic que, en actuar, genera un color observable a simple vista o amb colorímetre/espectrofotòmetre.

Components Clau de l'ELISA

• Antigen: Molècula que un organisme reconeix com a estranya, provocant una resposta immunitària específica. Són toxines elaborades per patògens, però també molècules de cèl·lules d'altres organismes.
• Anticossos: Glicoproteïnes plasmàtiques solubles produïdes per cèl·lules plasmàtiques (derivades de limfòcits B) que tenen la funció d'unir-se específicament als antígens, sent la resposta immunitària.

Tipus d'ELISA

L'ELISA indirecte es diferencia del directe perquè s'afegeix un sèrum problema que fa que els anticossos reaccionin específicament amb els antígens fixats al suport.