Conceptes Essencials: Lab Biologia Molecular i Citogenètica

Àrees del Laboratori

Sala Neta

En ella es preparen tots els reactius que s’utilitzaran en el laboratori. És fonamental que els reactius no es contaminin amb ADN. Són sales que tenen una lleugera pressió positiva per evitar l’entrada de qualsevol font de contaminació. És imprescindible que disposi d’una cabina de bioseguretat. S'utilitza per a cultius cel·lulars i tot allò que requereixi una contaminació zero.

Sala Bruta

Hauria de tenir una lleugera pressió negativa per evitar que s’escapi material contaminant. Ha d'incloure una cabina de bioseguretat i un espectrofotòmetre. S'utilitza per a seqüenciadors, tècniques d'hibridació, etc.

Prevenció de Contaminació

Contaminació Creuada

S'han d'utilitzar cabines de bioseguretat de classe II i puntes de micropipetes especials.

Prevenció de 'Carryover'

S'ha d'evitar revertir el flux de feina transportant mostres amplificades des de les àrees de PCR o post-PCR.

Conceptes Fonamentals

Definicions Clau

Biologia Molecular

Part de la biologia que estudia les composicions, les estructures i les funcions de les molècules biològicament importants, així com els processos implicats.

Citogenètica

Part de la genètica que estudia l'estructura, funció i comportament dels cromosomes en metafase.

Tècnica Asèptica

Es refereix al mètode preventiu que s’utilitza per mantenir estèrils tots els objectes o materials de manera que la curació s'aconsegueixi per primera intenció.

Seguretat

La seguretat és l'estat de protecció contra perills potencials i inclou tant la sensació personal d'estar sa i estalvi com les mesures adoptades per fer front a riscos i amenaces.

Traçabilitat

És la capacitat de reproduir l'historial d'un producte o procediment, i es refereix a l'acumulació d'informació sobre cada pas dels processos de producció, emmagatzematge i distribució per millorar-ne la qualitat.

Equipament de Laboratori

Equipament Genèric

• Cabina de bioseguretat
• Sistema de purificació d'aigua
• Espectrofotòmetre
• Microscopi de llum transmesa i fluorescència
• Autoclau
• Incubador o estufa
• Bany termostàtic, termobloc i placa calefactora
• Centrífuga i microcentrífuga
• Neveres i congeladors
• Altres: Balança, agitadors, vòrtex, pH-metre, etc.

Equipament Sala de Cultiu

• Cabina de flux laminar
• Incubadora de CO₂
• Microscopi invertit
• Equip de criogènia

Seguretat i Bones Pràctiques

5 Elements a Controlar en Tècnica Asèptica

• Rentat de mans
• Ús d'equips de protecció individual (EPI)
• Descontaminació de superfícies
• Prevenció de la contaminació ambiental
• Prevenció de 'carryover'

Ús Eficient dels Recursos: 5 Punts Clau

• Equipament i infraestructures
• Reactius
• Recursos humans
• Tècniques
• Gestió mediambiental

Tipus de Seguretat

• Biològica o bioseguretat: Prevenció contra agents patògens i toxines.
• Química: Prevenció contra agents químics.

Nivells de Bioseguretat

• Nivell 1: Risc nul o insignificant.
• Nivell 2: Risc baix.
• Nivell 3: Risc moderat.
• Nivell 4: Risc alt.

Mesures per a Productes Químics

• Prevenció de l'exposició del personal a aquestes substàncies.
• Emmagatzematge segur.
• Gestió eficient dels residus generats.
• Utilització dels EPI adequats a les possibles vies d'exposició.
• Prohibició de pipetejar amb la boca.
• Manipulació de productes volàtils en campanes d'extracció.
• Manipulació de productes inflamables lluny de fonts de calor.
• Etiquetatge correcte de tots els envasos.
• Emmagatzematge en armaris adaptats a la perillositat.

Normes Bàsiques de Comportament

• Rentat freqüent de mans.
• Utilització dels EPI adequats.
• Utilització de roba adequada per evitar tacar-se.
• Prohibició de menjar, beure, fumar i maquillar-se.
• Utilització d'ulleres de seguretat amb lents de contacte.
• Prohibició de pipetejar amb la boca.
• Rebre formació adequada per al maneig dels aparells.
• Conèixer el pla de gestió de residus i el manual de seguretat.

Tipus de Residus Generats

• Residus biosanitaris especials
• Residus químics
• Residus citotòxics
• Residus radioactius

Els contenidors han d'estar homologats, diferenciats per codis de colors i perfectament etiquetats.

Cromosomes i Citogenètica

Cromosoma

Estructura organitzada formada per l'associació d'una molècula d'ADN, que porta la informació genètica de l'individu, i un conjunt de proteïnes.

Parts del Cromosoma

• Cromàtides: Dos filaments paral·lels iguals units per cohesines.
• Centròmer: L'estrangulament que divideix el cromosoma en dos braços.
• Cinetocor: Punt d'ancoratge dels microtúbuls del fus mitòtic.
• Constricció secundària: Estrangulaments de les cromàtides menys profunds que el centròmer.
• Telòmers: Extrems de les cromàtides.

Índex Centromèric

Ic = p · 100 / (p + q)

Tipus de Cromosomes

• Metacèntrics: L'índex sol ser entre 45-50. Cromosoma ben format.
• Submetacèntrics: L'índex entre 25-45. Cromosoma menys format.
• Acrocèntrics: L'índex menor a 25. Forma amb una punta a dalt.
• Telocèntrics: L'índex 0. Sense el braç p.

Nombre de Cromosomes Humans

Tenim 46 cromosomes.

Cicle Cel·lular i Divisió

Mitosis

Consisteix en la divisió del nucli i en la distribució dels cromosomes entre les 2 cèl·lules filles de forma que ambdues rebin idèntic nombre de cromosomes.

Fases de la Mitosis

• Profase
• Metafase
• Anafase
• Telofase

Meiosi

Són divisions cel·lulars per formar gàmetes en les quals es redueix a la meitat el nombre de cromosomes. Consisteix en dues divisions successives (cada una amb les seves quatre fases: profase, metafase, anafase i telofase). Al final del procés, s'obtenen quatre gàmetes per cada cèl·lula mare que comença una meiosi.

Fases del Cicle Cel·lular

• Fase G1: La cèl·lula desenvolupa funcions habituals. L'ADN es transcriu per formar proteïnes.
• Fase S: Es produeix la replicació de l'ADN per iniciar la divisió cel·lular.
• Fase G2: Se sintetitzen proteïnes per a la divisió, es dupliquen els centríols i es condensa la cromatina. La cèl·lula està llesta per a la mitosi.

Citocinesi

Procés en el qual es reparteix el citoplasma i els orgànuls entre les dues cèl·lules filles.

Tècniques de Bandeig

• Bandeig G: Amb tripsina i Giemsa. Es tracten preparacions metafàsiques envellides amb tripsina i es tenyeixen després amb Giemsa.
• Bandeig R: S'obté un patró de bandes negatiu respecte al bandeig G. Es tracten les preparacions amb calor i es tenyeixen amb Giemsa.
• Bandeig Q: Tècnica de bandeig fluorescent en la qual s'utilitza quinacrina per tenyir.
• Bandeig C: Es tenyeixen les regions dels cromosomes riques en heterocromatina.

Idiograma i Nomenclatura

Idiograma

Representació gràfica simplificada d'un cromosoma tenyit amb una tècnica de bandeig.

Els cromosomes es classifiquen per cromosoma, braç, regió, banda, subbanda, subsubbanda. Ex: 14q32.13

Nomenclatura Citogenètica i Fórmula Cromosòmica

Sense Anomalies

Nombre total de cromosomes + cromosomes sexuals (XX, XY). Ex: 46,XX (dona) o 46,XY (home).

Anomalia Numèrica

Anomalia en el nombre de cromosomes, reflectida a la fórmula. Ex: 45,X (monosomia X), 47,XYY (trisomia Y).

Anomalia Estructural

Exemples:

• Translocacions no recíproques (inserció 'ins'): Ex. 46,XY,ins(10;3)(q22;p13p23) - Home amb inserció d'un fragment del cromosoma 3 (bandes p13-p23) al cromosoma 10 (banda q22).
• Translocacions Recíproques ('t'): L'ordre dels cromosomes a la fórmula és primer els sexuals si estan afectats, després els autosomes. Ex. 46,XY,t(X;17)(q23;q21) - Home amb translocació recíproca entre els cromosomes X i 17, amb punts d'intercanvi a Xq23 i 17q21.

Mosaicisme

('mos', signe '/'): Presència de dues o més línies cel·lulars genèticament diferents en un mateix individu. Ex. mos 47,XYY[15]/46,XY[30] - Individu amb mosaicisme. De 45 metafases analitzades (15+30), 15 mostren trisomia del cromosoma Y (47,XYY) i 30 són normals (46,XY).

Cariotip

Conjunt de cromosomes d'una espècie, un individu o una cèl·lula, ordenats segons la seva mida i morfologia.

Obtenció del Cariotip

Per poder ordenar-los cal veure'ls en metafase, cosa que s'aconsegueix amb un cultiu cel·lular. Les tècniques de bandeig i tinció permeten visualitzar-los i fer-ne l'anàlisi per obtenir el cariotip.

Tipus de Cariotip

• Cariotip d'espècie: Conjunt 'normal' de cromosomes que caracteritza una espècie determinada. És el cariotip amb el qual s'haurà de comparar per detectar anomalies.
• Cariotip d'individu: Cariotip amb el qual neix l'individu (el que contenen la major part de cèl·lules del seu organisme).
• Cariotip de cèl·lula: Conjunt de cromosomes que conté una cèl·lula. Pot definir el cariotip de l'individu o mostrar anomalies específiques (ex. cèl·lules tumorals).

Recompte i Anàlisi de Metafases

Per realitzar el cariotip s'analitzen un mínim de 20 metafases completes amb objectiu 100X. Es compten els cromosomes i es fa foto de les 5 millors metafases. En l'anàlisi complet, es compara cada cromosoma amb el seu homòleg per detectar canvis.

Criteris d'Ordenació dels Cromosomes

Els cromosomes s’ordenen seguint 3 criteris:

• Mida: De més gran a més petit.
• Posició del centròmer: Cromosomes de mida similar s'ordenen: 1r metacèntrics, 2n submetacèntrics i 3r acrocèntrics.
• Presència de constriccions secundàries: Hi ha 8 grups de cromosomes: 7 grups d'autosomes (A-G) i 1 grup de cromosomes sexuals (X, Y).

Grups d'autosomes: A (1-3), B (4-5), C (6-12), D (13-15), E (16-18), F (19-20), G (21-22).

Cariotip d'Alta Resolució

S'obté a partir de cromosomes en profase tardana o prometafase. S'indueix la sincronització de les cèl·lules per obtenir un major nombre de metafases o prometafases. Una incubació curta amb colchicina garanteix la presència de cromosomes en prometafase.

Mutacions

Canvis en el material genètic.

Mutacions Gèniques

Són aquelles que afecten un o diversos nucleòtids.

• Substitucions: És la mutació més simple, substitució d'un únic nucleòtid per un altre. Hi ha tres possibles situacions: mutació silenciosa, mutació de sentit erroni, mutació sense sentit.
• Insercions i delecions: La inserció suposa un guany de material genètic i la deleció la pèrdua de material.

Mutacions Cromosòmiques

Afecten el nombre de cromosomes o l'estructura.

Alteracions Cromosòmiques Numèriques (2 tipus)

• Poliploïdia: Existència de més de dos jocs cromosòmics complets. Amb tres dotacions: triploïdia; amb quatre: tetraploïdia.
• Aneuploïdia: Alteració numèrica que consisteix en la falta o l'excés d'un o diversos cromosomes. La falta d'un cromosoma es diu monosomia, tres trisomia, quatre tetrasomia.

Alteracions Cromosòmiques Estructurals

• Deleció: Pèrdua d'un fragment de cromosoma. Pot ser terminal (de l'extrem d'un braç) o intersticial (entre el centròmer i el telòmer).
• Duplicació: Repetició o duplicació d'un fragment de cromosoma.
  • Segons localització: En tàndem (a continuació de l'original), Desplaçada (entre les dues repeticions hi ha una altra regió).
  • Segons l'orientació: Directa (mateixa orientació que l'original), Invertida (invertida respecte l'original).
• Inversió: Un fragment de cromosoma es posa en posició invertida.
  • Es divideixen en: Pericèntriques (afecta el centròmer, per tant els 2 braços) i Paracèntriques (no afecta el centròmer, per tant un sol braç).
• Translocació: Intercanvi d'un o més fragments entre dos cromosomes no homòlegs.
  • Hi ha 3 tipus: No recíproca (part d'un l'agafa un altre), Recíproca (s'intercanvien els fragments), Robertsoniana (fusió de cromosomes acrocèntrics).
• Cromosoma en anell: Es perden els telòmers i el cromosoma es torna circular.
• Isocromosoma: 2 braços iguals però orientacions diferents.

Síndromes Cromosòmiques

• Síndrome de Down: Trisomia del cromosoma 21. Fórmula: 47,XX,+21 o 47,XY,+21. Incidència: ~1/700.
• Síndrome de Patau: Trisomia del cromosoma 13. Incidència: ~1/12000.
• Síndrome d'Edwards: Trisomia del cromosoma 18 o translocació que l'impliqui. Incidència: ~1/6000.
• Síndrome del Cri du Chat: Deleció del braç curt (p) del cromosoma 5. Fórmula: 46,XX,del(5p) o 46,XY,del(5p). Incidència: ~1/50000.
• Síndrome de Klinefelter: Presència d'un o més cromosomes X addicionals en homes (més comú 47,XXY). Incidència: ~1/1000 homes.
• Síndrome de Turner: Monosomia del cromosoma X (45,X) o deleció parcial del X. Incidència: ~1/2500-1/3000 nenes.
• Síndrome de DiGeorge: Microdeleció al braç llarg (q) del cromosoma 22, banda 11.2. Fórmula: 46,XX,del(22q11.2) o 46,XY,del(22q11.2). Incidència: ~1/4000.

"