Guia Pràctica per a la Preparació i Observació de Cariotips i Llevats

Cariotip: Protocol de Preparació

Abans d’utilitzar el medi, s’ha de deixar a temperatura ambient durant 15 minuts. S’utilitzen 5 ml de medi per tub cònic/alumne. Desinfectar la punta del dit amb alcohol al 70%, deixar assecar i punxar amb la lanceta. No utilitzar desinfectant iodat. Deixar caure 4-8 gotes directament al tub amb el medi. A partir d’aquest punt, ja no és necessari l’asèpsia. Incubar verticalment a 37ºC durant 48-72 hores al bany Maria. És molt important bellugar els tubs durant la incubació.

Afegir 0,5 ml de solució d’aturada atemperada a 37ºC i deixar incubar de 30 minuts (mínim) a 2 hores més (0,5 ml si les gotes són de xeringa). Resuspendre el cultiu. Centrifugar durant 10 minuts a 800 rpm (no passar de 1000 rpm) i extreure amb l’ajuda d’una pipeta Pasteur el sobrenedant, però deixant aproximadament 0,5 ml.

Afegir 6 ml de solució hipotònica atemperada a 37ºC gota a gota, remenant amb suavitat. Incubar els tubs durant màxim 18 minuts a 37ºC. (Nota: la solució hipotònica no pot estar en contacte amb les cèl·lules en excés, ja que es trencaria les parets cel·lulars). Centrifugar durant 8 minuts a 800 rpm. Descartar amb l’ajuda de la pipeta Pasteur el sobrenedant, deixant aproximadament 0,25-0,50 ml sobre les cèl·lules.

Afegir gota a gota 6 ml de solució fixadora FREDA (les pipetes Pasteur al congelador). S’ha d’anar insuflant aire suaument amb la pipeta entre cada 2 ml. Deixar els tubs 30 minuts o durant tota la nit a 4ºC segons necessitats del laboratori. Centrifugar els tubs durant 8 minuts a 800 rpm. Decantar deixant 0,5 ml del líquid sobre les cèl·lules i afegir com l’altra vegada (insuflant aire cada 2 ml) 6 ml de solució fixadora mantinguda a 4ºC i deixar-la altre cop a 4ºC de 30 minuts a 40 minuts (o durant tota la nit si cal per necessitats del laboratori).

Centrifugar 8 minuts a 800 rpm. Després d’aquesta segona fixació, decantar deixant novament 0,5 ml de líquid sobre les cèl·lules (en aquest punt també es pot esperar el procés tota la nit a 4ºC).

Preparació dels Portes

Posar a netejar els portes en solució de metanol al 70% (4 portes per alumne). Utilitzant pinces, treure els portes de la solució i deixar-los assecar posant-los inclinats, tocant un costat un paper secant. Barrejar amb l’ajuda de la pipeta Pasteur el contingut del tub (compte de no deixar entrar massa porció de líquid dintre de la pipeta, es perdrien cèl·lules). Deixar caure verticalment, amb l’ajuda de la pipeta Pasteur i des de 25-50 cm d’alçada, 2 gotes de la suspensió cel·lular per porta. Deixar assecar a l’aire.

Tenyir el porta amb Giemsa durant 10 minuts. Treure i rentar amb aigua destil·lada o aigua de l’aixeta. Netejar el costat de sota del porta amb un paper. Observar: buscar a 100x i 400x les metafases. Observar a 1000x amb oli d’immersió les metafases trobades.

Observació del Llevat

1. Omplir 3 vasos precipitats amb aigua destil·lada i amb una culleradeta de llevat cada un. A un dels vasos li hem afegit una cullerada de sucre i l’hem deixat reposar durant mitja hora. A un altre vas li afegim una mica d’àcid.
2. Amb una pipeta Pasteur (una per cada vas) posem una gota de cada un d’ells a un porta (3 en total, prèviament rotulats).
3. Es fixa la preparació amb lugol: 2 minuts.
4. Es tenyeixen les mostres amb blau de metilè i es deixa actuar durant 5 minuts.
5. Es renten les mostres amb aigua amb el flascó-rentador: durant 2 minuts (fins que “la gota” quedi transparent).
6. Es deixa assecar a l’aire.
7. S’observa al microscopi amb l’augment de 100X i oli.