Vectors Virals: Retrovirus, Lentivirus i Adenovirus

Retrovirus: Vectors i Característiques

Els retrovirus estan formats per dues molècules d'ARN lineal de 8,3 kb. Només infecten cèl·lules en divisió, però no les maten, i estableixen una simbiosi indefinida. Per a la seva replicació, necessiten l'enzim transcriptasa inversa.

Elements del Genoma del Retrovirus Salvatge

• Elements en CIS: Inclouen l'origen de replicació (ORI) i el senyal d'empaquetament.
• Elements en TRANS: Comprenen les proteïnes de la càpsida i les proteïnes reguladores.
• Regió Repetida (R): Està flanquejada per seqüències úniques: U5 (a l'extrem 5') i U3 (a l'extrem 3'). La transcripció s'inicia a la regió R del terminal 5' a partir del promotor U3 i s'acaba a la mateixa regió R de l'extrem 3'.
• Regió Interna: Formada per tres gens principals:
  • gag: Produeix un antigen (Ag) característic del grup.
  • pol: Codifica la polimerasa de transcripció inversa.
  • env: Codifica la proteïna de l'envoltura.

Desenvolupament de Vectors Vírics

Per construir els vectors, s'introdueixen els elements en CIS. Aquest vector també conté el casset d'expressió. D'altra banda, l'ADN helper conté els elements en TRANS i se n'elimina el senyal d'empaquetament. Aquests vectors es desenvolupen amb tres finalitats principals:

• Augmentar l'eficiència de transcripció.
• Obtenir un nombre més gran de transformats estables.
• Augmentar la diversitat de cèl·lules transfectables.

La manipulació dels vectors es duu a terme sobre la seva forma replicativa, l'ADN de doble cadena (dsDNA).

Vectors SIN (Self-Inactivating)

Són vectors que s'autoinactiven. Resulten especialment útils per a la síntesi de la proteïna d'interès, ja que minimitzen el risc d'activació d'oncogens.

Lentivirus: Vectors d'Expressió a Llarg Termini

Els lentivirus són retrovirus no oncogènics i no immunogènics capaços d'infectar tota mena de cèl·lules (tant en divisió com quiescents). S'integren en el genoma de l'hoste, la qual cosa dona lloc a una expressió gènica estable i a llarg termini. El genoma de tipus salvatge (wild-type) està format per dues repeticions terminals llargues (LTR) que flanquegen els gens interns gag, pol i env. Realitzen splicing, originant les proteïnes Rev i Tat, aquesta última necessària per a la transcripció.

Components d'un Vector Lentiviral

• LTR/CMV: Un promotor híbrid que permet una expressió mínima per a la replicació, però que també garanteix la independència de la proteïna Tat.
• RRE (Rev Response Element): Element en CIS que permet als transcrits sortir del nucli i empaquetar-se correctament.
• cPPT (central Polypurine Tract): Augmenta l'eficàcia del transport de l'ARN del nucli al citoplasma.
• WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element): Element de resposta posttranscripcional que augmenta la producció de la proteïna d'interès.

Els vectors lentivirals recombinants requereixen construccions d'empaquetament per a la seva producció.

Adenovirus: Vectors No Integratius

Els adenovirus són un tipus de virus amb un genoma d'ADN (de cadena doble o senzilla, lineal o circular) que entra a la cèl·lula per endocitosi. La variació del pH dins l'endosoma provoca l'alliberament del material genètic, que migra al nucli per ser transcrit. Un avantatge clau és que no s'integren en el genoma de l'hoste.

El genoma salvatge dels adenovirus consisteix en un ADN de doble cadena (dsDNA) de 35 kb. La primera regió a transcriure's és l'E1A, que consta de dos gens els productes dels quals estimulen la transcripció de les regions E1B, E2A, E2B, E3 i E4. El genoma posseeix en els seus extrems repeticions terminals invertides (ITR) i un senyal d'empaquetament.

Modificació dels Adenovirus com a Vectors

Per utilitzar el vector, convé eliminar la regió E1. Per tant, serà defectiu i necessitarà un helper (ja sigui un altre virus o cèl·lules empaquetadores com les HEK 293) que aporti els gens necessaris per replicar-se. També s'eliminen les regions E3, E4 i E2 per deixar espai al gen que es vol clonar.

Vectors Gutless (Sense Gens)

Són vectors dependents d'helper que han estat desproveïts de gairebé tots els gens virals. Només contenen el senyal d'empaquetament i les ITR, la qual cosa maximitza l'espai per a l'ADN d'interès i redueix la resposta immunitària.